實時熒光定量PCR
實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)是一種由PCR技術發(fā)展而來的分子生物學技術,它可以通過在DNA擴增過程中使用熒光染料來偵測每個PCR循環(huán)后產(chǎn)物的總量,具有PCR技術快速、靈敏的特點,同時還具有更高的特異性、實時監(jiān)測和可重復精確定量等優(yōu)勢。
qPCR化學原理-探針法
qPCR實驗流程包括RNA提取、逆轉錄和qPCR。
探針法qPCR原理圖,源自網(wǎng)絡,侵刪
qPCR探針法是一種使用熒光探針來測量PCR產(chǎn)物的技術。在PCR反應中,熒光探針會與PCR產(chǎn)物的特定序列結合,并發(fā)生熒光變化。隨著PCR反應的進行,PCR產(chǎn)物的數(shù)量增加,熒光探針與PCR產(chǎn)物結合的數(shù)量也會隨之增加。通過測量熒光信號的強度,可以確定PCR產(chǎn)物的數(shù)量。
qPCR化學原理-染料法
qPCR染料法是一種使用DNA結合染料來測量PCR產(chǎn)物的技術。在PCR反應中,DNA結合染料會與PCR產(chǎn)物的雙鏈DNA結合,從而發(fā)生熒光變化。隨著PCR反應的進行,PCR產(chǎn)物的數(shù)量增加,DNA結合染料的熒光信號也會隨之增加。通過測量熒光信號的強度,可以確定PCR產(chǎn)物的數(shù)量。
染料法qPCR原理圖,源自網(wǎng)絡,侵刪
RNA提取
樣本采集與保存
RNA提取的第一步是樣本采集和保存。對于細胞和組織樣本,需要在采集后盡快進行RNA提取,以避免RNA的降解。對于血液樣本,需要使用RNA穩(wěn)定劑或直接進行RNA提取。另外,樣本的保存溫度和時間也需要根據(jù)不同的實驗目的進行選擇。
樣本處理
樣本前處理是為了去除樣品中的細胞碎片、蛋白質(zhì)、DNA等雜質(zhì),從而提高RNA的純度。常見的樣本前處理方法包括離心、過濾和洗滌等。
樣本裂解
樣本裂解是將細胞膜破壞,使RNA釋放到溶液中的過程。常見的樣本裂解方法包括機械裂解、化學裂解和熱裂解等。
提取純化
RNA提取后,需要進行純化并去除DNA、蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)。RNA純化試劑盒、硅膠柱和磁珠等方法都可以用于RNA提取后的純化。需要注意使用RNase-free試劑和器具,并在純化過程中避免RNA的降解。
質(zhì)量檢測
RNA提取后,需要進行質(zhì)量檢測以確保RNA的完整性和純度??梢允褂蒙锓治鰞x或瓊脂糖凝膠電泳等方法進行質(zhì)量檢測。
逆轉錄
逆轉錄反應
逆轉錄反應是將RNA轉錄成cDNA的過程。將提取的RNA與逆轉錄酶、引物(如oligo(dT)或隨機引物)和dNTPs混合,在適宜的溫度下進行反轉錄反應,合成cDNA。
逆轉錄反應溫度和時間需要根據(jù)逆轉錄酶的不同而進行選擇。
cDNA純化
逆轉錄反應后,需要將cDNA純化并去除RNA、逆轉錄酶等雜質(zhì)??梢允褂胏DNA純化試劑盒或磁珠等方法進行純化。
qPCR
引物設計
qPCR染料法的引物設計原則與其他PCR反應的引物設計原則基本相同,主要考慮以下因素:
(1)引物長度:通常為18-24個堿基對;
(2)引物Tm值:應當在55-65℃之間;
(3)引物特異性:應當避免與非目標序列的互補;
(4)引物末端修飾:可以增強引物的特異性和穩(wěn)定性。
內(nèi)參選擇
內(nèi)參是用于校正樣品間差異的參照基因。內(nèi)參應當具有以下特點:
(1)在不同樣品中表達穩(wěn)定;
(2)與目標基因同等易檢測;
(3)不會受到實驗條件的影響。
常見的內(nèi)參包括GAPDH、Actin、Tublin等。
模板用量
確定qPCR實驗中cDNA模板的稀釋度數(shù)需要進行預實驗來確定最佳的稀釋倍數(shù)。以下是一些步驟:
(1)準備一系列不同濃度的cDNA稀釋液,例如原液、1:10、1:100等;
(2)進行qPCR反應,并記錄Ct值;
(3)選擇Ct值在18-28范圍內(nèi)的稀釋倍數(shù)。
程序設置
在qPCR實驗中,程序設置通常包括以下步驟(具體參照說明書進行):
(1)預變性:95℃,5min;
(2)循環(huán)反應:95℃,30s;55℃,30s;72℃,30s;40個循環(huán)。
注:循環(huán)反應可分為兩步法和三步法。兩步法將常規(guī)PCR反應中的退火、延伸步驟進行合并,因此減少了反應步驟、縮短了反應時間。一般情況下,使用兩步法程序進行擴增即可滿足實驗需求。如果模板濃度低或qPCR擴增效率低時,可嘗試三步法反應程序。
在分子生物學研究和臨床診斷領域,實時熒光定量PCR(qPCR)技術以其高靈敏度、高特異性和準確性而成為不·可·或·缺的工具。
今天,給大家推薦一款專為丁型肝炎病毒(HDV)RNA設計的qPCR檢測利器——RoboGene HDV RNA Quantification Kit 2.0。
RoboGene HDV RNA 定量試劑盒 2.0 旨在使用即時病毒 RNA/DNA 試劑盒對人 EDTA 血漿或血清樣本中的丁型肝炎病毒 (HDV) RNA 進行實時 PCR 定量。
雙重試劑盒版本
提供兩種不同的試劑盒版本,一種是用于LightCycler® 480和7500 Fast實時PCR系統(tǒng)的0.1 ml(白色)低輪廓試紙條,另一種是用于Rotor-Gene™ 3000/6000/Q的0.2 ml(透明)常規(guī)試管。
高靈敏度和寬線性范圍
手動純化下的檢測限(LoD)為6 IU/ml,線性范圍從5至1x10^8 IU/ml,這表明試劑盒具有出色的靈敏度和寬泛的定量范圍。
廣泛的基因型覆蓋
能夠檢測1至8型HDV RNA,適用于全球不同地區(qū)流行的HDV基因型。